Microscopia Elettronica

Differenze tra elettroni e raggi X. Le principali tecniche di microscopia elettronica utilizzate nello studio strutturale di proteine. Il microscopio elettronico: sorgente, lenti elettomagnetiche, goniometro, detector. Camere a detezione diretta e loro caratteristiche. Principi fisici di formazione dell'immagine nel microscopio: approssimazione "weak phase object", effetto della lente dell'obiettivo (astigmatismo e aberrazione sferica), funzione d'onda nel piano focale posteriore (back focal plane), formazione dell'immagine. Contrast Transfer Function (CTF) e sua correzione con phase flipping e filtro di Wiener.

Tecniche di microscopia elettronica per la biologia strutturale ad alta risoluzione. Raccolta dei dati: immagini e pattern di diffrazione. Crstallografia a elettroni. Preparazione dei cristalli bidimensionali. Preparazione del campione: negative staining e cryo-EM (sugar embedding). Raccolta dei dati di diffrazione: lo spazio reciproco dei cristalli bidimensionali. Analisi dei dati di diffrazione. Analisi delle immagini di microscopia elettronica di cristalli bidimensionali: filtering, unbending, correzione della CTF e merging per ottenere la mappa di proiezione. Due esempi di strutture ottenute con cristallografia a elettroni: bacteriorodopsina e acquaporina-0. Microscopia elettronica su particelle singole: Single-particle EM. Preparazione del campione per single-particle cryo-EM.