Topic outline

  • Introduzione

    Benvenuto sul sito del corso a scelta di Spettroscopia Ottica Biomedica (3 CFU). 
    La biofotonica in generale, ed in particolare le tecniche di microscopia ed imaging basate sulla fluorescenza, sono diventate patrimonio comune di molti laboratori avanzati di biotecnologie. Si pensi ad esempio al premio Nobel per la Chimica 2014, conferito a tre scienziati per aver sviluppato tecniche di nanoscopia ottica per studiare in dettaglio cellule e tessuti biologici.

    Il corso è pensato come introduzione alla biofotonica, ed è un "tutorial" sulle principali tecniche spettroscopiche e di imaging avanzate correntemente utilizzate nei laboratori di ricerca in ambito biologico e biotecnologico. 

    Lo scopo è dunque di introdurre in modo qualitativo i concetti fondamentali delle spettroscopie e delle rispettive tecniche di imaging basate su fluorescenza (e.g. FLI, FRET, STED, fluorescenza a due fotoni), infrarosso (FT-IR, ATR) e Raman (e.g. SERS, CARS), e quindi vedere degli esempi di applicazioni presi da recente letteratura scientifica. Particolare importanza sarà data alle tecniche di imaging molecolare, applicate a sistemi in vitro (colture cellulari e tessuti) ed in vivo (animali).

    Il corso prevede anche una visita presso il laboratorio di spettroscopia/imaging di fluorescenza e Raman, con delle brevi dimostrazioni (in presenza del docente) su alcune delle tecniche affrontate nel corso.

    • Programma

      Per il programma completo si prega di fare riferimento al Syllabus del corso.

      La struttura di base del corso si divide in tre parti, di circa 8 ore ciascuna (per un totale di 24 ore):

      1. Introduzione generale alla spettroscopia ottica e biofotonica, che include dei cenni alla interazione tra radiazione e materia, con particolare riferimento a sistemi biologici; cenni di strumentazione usata in biofotonica, inclusa una breve esercitazione nella quale gli studenti si costruiranno un mini-spettroscopio per l'osservazione di spettri con la videocamera del proprio smartphone;

      2. Introduzione alla fluorescenza, che include dei cenni di teoria e numerosi esempi di applicazioni (incluse le tecniche STED, FRET, FLIM e altre ancora) prese dalla letteratura scientifica recente;

      3. Introduzione alle spettroscopie vibrazionali, che include dei cenni di teoria e l'introduzione di tecniche spettroscopiche e di imaging quali IR, Raman, SERS, CARS e SRS;


      • Materiale didattico

        Le slides utilizzate a lezione possono essere scaricate da questo link, inserendo la password indicata dal docente.

        Un file PDF contenente materiale integrativo di supporto didattico può essere scaricato da questo link, inserendo la password indicata dal docente.

        Per quanto riguarda eventuali testi, non ci sono ancora manuali dedicati a questa disciplina, ed il corso è costruito attingendo da vari testi, quali ad esempio

        Introduzione generale a metodi e strumentazione in spettroscopia ottica
        • Prasad "Introduction to Biophotonics", Wiley, 2003
        • Skoog, West, Holler, Crouch "Fundamentals of Analytical Chemistry", Brooks/Cole, 2014 - (DIP. SCI. CHIMICHE DO 05./A / 0004; DO 04/32 / 0150)
        • Hammes "Spectroscopy for the Biological Sciences", Wiley, 2005 - (DIP. SCI. CHIMICHE DO 04/06 / 0400)
        • Harvey "Modern Analytical Chemistry", McGraw Hill, 2000
        Fluorescenza
        • Lakowicz "Principles of Fluorescence Spectroscopy", Springer, 2006 (DIP. SCI. CHIMICHE DO 04/06 / 0385)
        • Valeur and Beberan-Santos "Molecular Fluorescence", Wiley-VCH, 2012 (DIP. SCI. CHIMICHE DO 04/06 / 0296)
        IR and Raman
        • Larkin "IR and Raman Spectroscopy: Principles and Spectral Interpretation", Elsevier, 2011 (BIB. TECNICO SCIENTIFICA H0 33 / 0015)
        • Smith and Dent "Modern Raman Spectroscopy: a practical approach", Wiley, 2005 (B. DIP. MAT.RISOR.NAT.-ING.MATERIALI 05./I /0012; DIP. SCI. CHIMICHE DO 04/06 /0336)
        • Vandenabeele "Practical Raman Spectroscopy - an introduction", Wiley, 2013
        Altri testi per approfondimenti
        • Pavia, Lampman, Kriz, Vyvyan "Introduction to Spectroscopy", Brooks/Cole, 2009

        Non si richiede l'acquisto di testi (molto costosi o fuori catalogo), ed il corso può essere seguito anche solo con le informazioni passate a lezione, e tramite le slides. Alcuni di questi testi sono presenti presso le biblioteche dell'Università (la collocazione è indicata di seguito ai dati del testo), e comunque, su richesta, potrò dare in visione alcuni di questi testi agli studenti interessati.
         

        • Links

          Links per websites che spiegano come auto-costruirsi degli spettrografi o monocromatori in casa.

          • Software

            Per far girare lo script per trasformare le immagini di spettri in grafici (dati) XY sul proprio computer, seguire le istruzioni:


            1. Scaricare ed installare sul proprio computer il software gratuito da www.r-project.org (Downoad > CRAN > ...)

            2. Scaricare ed installare l'interfaccia gratuita RStudio da www.rstudio.com

            3. Aprire RStudio, cliccare sulla tab "Packages" nel riquadro in basso a destra, cliccare "Install" ed installare i pacchetti "shiny", "imager" e "MALDIquant"

            4. Scaricare l'archivio app.ZIP da questo link (stessa password usata per scaricare le slides)

            5. Estrarre il contenuto dell'archivio in una cartella "specgraph" (da creare apposta sul proprio computer)

            6. Aprire il file app.R con RStudio, e cliccare il tasto "Run App" al centro in alto. 
                L'applicazione dovrebbe aprirsi nel browser di default.

            Poi basta seguire le solite istruzioni come indicate nella sezione "links".
            Lo script è stato testato sia su Windows che su Mac.

            • Modalità esame

              La prova d'esame consisterà

              1) nella presentazione di una breve relazione sperimentale (3-5 pagine), redatta a gruppi di 3-5 studenti, sulle esperienze effettuate con lo spettrografo. La relazione dovrà contenere una breve introduzione, una descrizione dello strumento e dei metodi utilizzati (es. calibrazione) ed una parte con la descrizione dei dati ottenuti (spettri acquisiti, almeno da 3 diverse sorgenti/esperimenti), eventualmente commentati e discussi.

              2) nella presentazione e discussione di un articolo scientifico, scelto dallo studente (ma concordato con il docente via e-mail almeno una settimana prima dell' esame), inerente alle tematiche affrontate nel corso. La presentazione del lavoro sarà di tipo seminariale, e gli studenti sono invitati all'utilizzo di Powerpoint o applicazioni affini. Tutte le presentazioni avverranno nel corso di una giornata-simposio, a cui tutti gli studenti sono invitati a particpare.

              Le relazioni in formato PDF (file con nome "(cognomi)_relazione.pdf") dovranno essere caricate al link riportato sotto entro una settimana dalla data di esame. 


              Il punteggio finale (in /30) verrà calcolato secondo il seguente schema:

              - relazione sperimentale: da 10 a 14 punti
              - presentazione: da 9 a 13 punti
              - domande fatte e/o ricevute (*): 1 punto per ogni domanda, fino ad un massimo di 3

              (*) ogni domanda fatta ai presentatori vale 1 punto per chi fa la domanda ed un punto per chi la riceve


              Le date degli appelli per gli studenti del corso sono pubblicate in ESSE3 o sul sito del Dipartimento (https://www.biologia.units.it/). GLi studenti potranno iscriversi all' esame attraverso le solite procedure tramite ESSE3.

            • Tutorial per la calibrazione del mini-spettrografo

              Ecco alcune indicazioni sul come acquisire le immagini a righe ottenute dal proprio smartphone (intensità luce su pixels in x e y), ed elaborarle in spettri veri e propri (intensità luce vs. lunghezza d'onda in nm).

              1. fissare il mini-spettrografo sul proprio smartphone con il nastro adesivo;

              2. acquisire una immagine spettrale della luce emessa da una lampadina a fluorescenza (no LED, no incandescenza) dal proprio smartphone utilizzando il mini-spettrografo costruito. Questa immagine dovrebbe avere almeno 4 righe colorate ben visibili, e servirà a calibrare la camera del vostro smartphone per le prossime immagini che verranno acquisite;


              FIGURA 1. Esempio di spettro a righe di una lampada a fluorescenza, usata per la calibrazione.


              3. senza spostare la posizione del mini-spettrografo, acquisire in serie altre immagini spettrali da altre sorgenti di luce; ogni volta che il mini-spettrografo viene spostato o rimosso, la prima immagine a righe ad essere acquisita deve sempre essere quella di una lampada a fluorescenza;

              4. in caso, ruotare le immagini a righe in modo da avere una serie di righe verticali, con le righe blu a sinistra e quelle rosse a destra;

              5. per ogni immagine, caricarla (formato .jpg) nell' applicazione online per trasformare l' immagine a righe in spettro, e scaricare il file con i dati in formato ASCII da aprire poi in MS Excel; per lo spettro della lampadina a fluorescenza, prendere nota della posizione (in pixel) delle 4 bande più intense (serviranno per la calibrazione in Excel);


              FIGURA 2. Esempio di spettro ottenuto da una immagine a righe.


              6. Usare le posizioni delle bande della lampadina a fluorescenza (spettro noto, vedi figura 1) in excel per calibrare l'asse delle x (pixels), trasformandolo in lunghezza d'onda (nm), in modo da ottenere spettri Intensità/lunghezza d'onda (nm). Vedi figura 3.