Topic outline

  • General

    • BIOCRISTALLOGRAFIA E MICROSCOPIA ELETTRONICA

      Docente: Rita De Zorzi
      Anno accademico: 2022/2023
    • ORARI DEL CORSO

      Il corso di Biocristallografia e Microscopia Elettronica inizierà il giorno 2 marzo e seguirà l'orario riportato qui sotto.
      • lunedì ore 14.15-16.00 - aula A8, edificio C11
      • giovedì ore 14.15-16.00 - aula A7, edificio C11
      Il corso prevede 5 CFU di lezioni teoriche (40 ore di lezione frontale) e 1 CFU di laboratorio (12 ore). Le ore di laboratorio verranno svolte al termine delle lezioni teoriche, con orario da concordare con gli studenti.

      Per domande, contattare la docente all'indirizzo:
      rdezorzi@units.it.

  • Introduzione

  • Struttura delle proteine

  • Espressione e purificazione di proteine ricombinanti

    • Espressione di proteine ricombinanti File PDF document

      Espressione di proteine ricombinanti per gli studi strutturali. Design del costrutto. Scelta del sistema di espressione. Principali tecniche di biologia molecolare utilizzate in biologia strutturale.

    • ExPASy URL

      Portale contenente diverse risorse bioinformatiche, inclusi database e software con accesso online di interesse per la biologia strutturale.

    • UniProt URL

      Database di sequenze proteiche, contenente anche annotazioni riguardo localizzazione, funzione, struttura, modifiche post-traduzionali, ecc. Sul sito sono a disposizione anche strumenti bioinformatici per l'allineamento delle sequenze.

    • Purificazione di proteine ricombinanti File PDF document

      Tecniche di purificazione. Metodi per aumentare la stabilità, l'omogeneità conformazionale e la cristallizzabilità di una proteina. Valutazione della qualità e purezza del campione. Analisi della stabilità conformazionale. Analisi dello stato oligomerico della proteina.

  • Cristalli di proteine

    • Cristallizzazione di proteine File PDF document

      Cristallizzazione di proteine solubili e di membrana. Aspetti termodinamici e aspetti cinetici della cristallizzazione. Tecniche di cristallizzazione. Strategie di ottimizzazione. Co-cristallizzazione e soaking.

    • Simmetrie dei cristalli File PDF document

      Cristalli di proteine. Gruppi puntuali di simmetria. Simmetrie nei cristalli. Sistemi cristallini. Reticoli di Bravais. Elementi di simmetria rototranslazionale. Coordinate frazionarie. Gruppi spaziali. Tavole Internazionali di Cristallografia. Simmetrie non cristallografiche. Indici di Miller e reticolo reciproco.

  • Diffrazione

    • Principi di diffrazione File PDF document

      Diffrazione di raggi X: concetti base sulla fisica della diffrazione. Legge di Bragg. Sfera di Ewald e reticolo reciproco. Simmetria del reticolo reciproco. Classi Laue. Assenze sistematiche. Scattering anomalo.

    • L'esperimento di diffrazione di raggi X da cristallo singolo File PDF document

      Strumentazione: sorgente di raggi X, componenti ottiche del diffrattometro, goniometro, detector. Raffreddamento del cristallo per cryocrystallography. Centratura del cristallo. L'esperimento di diffrazione. Ottimizzazione dei parametri della raccolta dati. Indicizzazione. Integrazione. Determinazione del gruppo spaziale. Scalatura e merging. Valutazione della qualità della raccolta dati. Danno da radiazione. Twinning. (Cenni a Serial Femtosecond Crystallography, SFX, con X-ray Free Electron Laser, X-FEL.)

  • Risoluzione del problema della fase

    • Il problema della fase File PDF document

      Fattori di struttura e densità elettronica. Trasformata di Fourier e sue proprietà. Convoluzione. Moduli e fasi. Il problema della fase. Funzione di Patterson. Volume di Matthews. Metodi di risoluzione del problema della fase.

    • Phasing/1: Molecular Replacement File PDF document

      Tecniche di risoluzione del problema della fase attraverso Molecular Replacement. Correzione del solvente di bulk. Tecniche di Density Modification. Solvent flattening/flipping. Histogram matching. Simmetria non cristallografica e individuazione degli operatori di rotazione e traslazione. Density averaging.

    • Phasing/2: Experimental Phasing File PDF document

      Tecniche di risoluzione del problema della fase basate sulla sostituzione isomorfa e tecniche basate sulla diffrazione anomala. Preparazione dei dati. Determinazione della posizione dell'atomo pesante o dell'atomo con scattering anomalo: metodi diretti e metodi Patterson. SIR: Single Isomorphous Replacement. SAD: Single-wavelength Anomalous Diffraction. Risoluzione dell'ambiguità sulle fasi determinate con SIR o SAD. MIR: Multiple Isomorphous Replacement. MAD: Multiple-wavelength Anomalous Diffraction. Mappe di densità elettronica. Risoluzione ed elementi strutturali.

    • Costruzione del modello e affinamento della struttura File PDF document

      Dalle fasi alla densità elettronica. Costruzione del modello. Affinamento nello spazio reciproco. Osservabili e parametri. Restraint e constraint. Funzioni minimizzate per l'ottimizzazione dei parametri. Protocollo di affinamento. Conformazioni delle catene laterali. Modellazione del solvente e di ligandi. Rfree e Rwork.

    • Validazione della struttura cristallografica File PDF document

      Importanza della validazione. Statistica Bayesiana applicata alla validazione del modello cristallografico. Parametri globali e parametri locali. Analisi della geometria: angoli e distanze di legame, diagramma di Ramachandran, interazioni repulsive. Analisi della densità elettronica e parametri di correlazione per singoli residui. Validazione di presenza e geometria dei ligandi.

    • Always be careful in evaluating what you read... File PDF document

      Read the paper and spot significant crystallographic mistakes!

  • Microscopia Elettronica

    • Introduzione alla microscopia elettronica File PDF document

      Differenze tra elettroni e raggi X. Le principali tecniche di microscopia elettronica utilizzate nello studio strutturale di proteine. Il microscopio elettronico: sorgente, lenti elettomagnetiche, goniometro, detector. Camere a detezione diretta e loro caratteristiche. Principi fisici di formazione dell'immagine nel microscopio: approssimazione "weak phase object", effetto della lente dell'obiettivo (astigmatismo e aberrazione sferica), funzione d'onda nel piano focale posteriore (back focal plane), formazione dell'immagine. Contrast Transfer Function (CTF) e sua correzione con phase flipping e filtro di Wiener. Phase plate.

    • Cristallografia a elettroni File PDF document

      Tecniche di microscopia elettronica per la biologia strutturale ad alta risoluzione. Raccolta dei dati: immagini e pattern di diffrazione. Crstallografia a elettroni. Preparazione dei cristalli bidimensionali. Preparazione del campione: negative staining e cryo-EM (sugar embedding). Raccolta dei dati di diffrazione: lo spazio reciproco dei cristalli bidimensionali. Analisi dei dati di diffrazione. Analisi delle immagini di microscopia elettronica di cristalli bidimensionali: filtering, unbending, correzione della CTF e merging per ottenere la mappa di proiezione. Due esempi di strutture ottenute con cristallografia a elettroni: bacteriorodopsina e acquaporina-0. Microscopia elettronica su particelle singole: Single-particle EM. Preparazione del campione per single-particle cryo-EM.

  • Analisi dei dati EM Single-Particle

    • Allineamento, classificazione e averaging di immagini 2D File PDF document

      Segnale e rumore nelle immagini di microscopia elettronica. Teorema del campionamento. Grandezze fondamentali. Low-pass filtering. Selezione delle particelle e masking. Riduzione del rumore mediante averaging. Selezione automatica delle particelle. Allineamento: procedura di analisi della rotazione e della traslazione. Eterogeneità del campione. Classificazione: Principal Component Analysis e metodi di classificazione di immagini bidimensionali. Metodo della classificazione gerarchica ascendente. Metodo K-means. Esempi di utilizzo della classificazione in negative staining e in cryo. 

  • Esercitazioni