007CM - BIOCRISTALLOGRAFIA E MICROSCOPIA ELETTRONICA 2022
Section outline
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Introduzione alla biologia strutturale: importanza della relazione struttura-proprietà. Banche dati di proteine. Software per la visualizzazione della struttura di proteine.
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Meccanismo dell'enzima, ipotizzato a partire dalle strutture cristallografiche ottenute in diversi stati.
Il video è stato preparato con UCSF Chimera a partire da file di coordinate disponibili su PDB.
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Questo video è quello generato dalla procedura descritta nelle ultime slide dell'introduzione.
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Elementi di struttura delle proteine. Struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria, con esempi. Vincoli geometrici e gradi di libertà. Modifiche post-traduzionali e cofattori. Motivi e domini. Proteine di membrana.
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Espressione di proteine ricombinanti per gli studi strutturali. Design del costrutto. Scelta del sistema di espressione. Principali tecniche di biologia molecolare utilizzate in biologia strutturale.
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Portale contenente diverse risorse bioinformatiche, inclusi database e software con accesso online di interesse per la biologia strutturale.
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Database di sequenze proteiche, contenente anche annotazioni riguardo localizzazione, funzione, struttura, modifiche post-traduzionali, ecc. Sul sito sono a disposizione anche strumenti bioinformatici per l'allineamento delle sequenze.
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Tecniche di purificazione. Metodi per aumentare la stabilità, l'omogeneità conformazionale e la cristallizzabilità di una proteina. Valutazione della qualità e purezza del campione. Analisi della stabilità conformazionale. Analisi dello stato oligomerico della proteina.
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Cristallizzazione di proteine solubili e di membrana. Aspetti termodinamici e aspetti cinetici della cristallizzazione. Tecniche di cristallizzazione. Strategie di ottimizzazione. Co-cristallizzazione e soaking.
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Cristalli di proteine. Gruppi puntuali di simmetria. Simmetrie nei cristalli. Sistemi cristallini. Reticoli di Bravais. Elementi di simmetria rototranslazionale. Coordinate frazionarie. Gruppi spaziali. Tavole Internazionali di Cristallografia. Simmetrie non cristallografiche. Indici di Miller e reticolo reciproco.
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Diffrazione di raggi X: concetti base sulla fisica della diffrazione. Legge di Bragg. Sfera di Ewald e reticolo reciproco. Simmetria del reticolo reciproco. Classi Laue. Assenze sistematiche. Scattering anomalo.
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Strumentazione: sorgente di raggi X, componenti ottiche del diffrattometro, goniometro, detector. Raffreddamento del cristallo per cryocrystallography. Centratura del cristallo. L'esperimento di diffrazione. Ottimizzazione dei parametri della raccolta dati. Indicizzazione. Integrazione. Determinazione del gruppo spaziale. Scalatura e merging. Valutazione della qualità della raccolta dati. Danno da radiazione. Twinning. (Cenni a Serial Femtosecond Crystallography, SFX, con X-ray Free Electron Laser, X-FEL.)
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Fattori di struttura e densità elettronica. Trasformata di Fourier e sue proprietà. Convoluzione. Moduli e fasi. Il problema della fase. Funzione di Patterson. Volume di Matthews. Metodi di risoluzione del problema della fase.
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Tecniche di risoluzione del problema della fase attraverso Molecular Replacement. Correzione del solvente di bulk. Tecniche di Density Modification. Solvent flattening/flipping. Histogram matching. Simmetria non cristallografica e individuazione degli operatori di rotazione e traslazione. Density averaging.
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Tecniche di risoluzione del problema della fase basate sulla sostituzione isomorfa e tecniche basate sulla diffrazione anomala. Preparazione dei dati. Determinazione della posizione dell'atomo pesante o dell'atomo con scattering anomalo: metodi diretti e metodi Patterson. SIR: Single Isomorphous Replacement. SAD: Single-wavelength Anomalous Diffraction. Risoluzione dell'ambiguità sulle fasi determinate con SIR o SAD. MIR: Multiple Isomorphous Replacement. MAD: Multiple-wavelength Anomalous Diffraction. Mappe di densità elettronica. Risoluzione ed elementi strutturali.
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Dalle fasi alla densità elettronica. Costruzione del modello. Affinamento nello spazio reciproco. Osservabili e parametri. Restraint e constraint. Funzioni minimizzate per l'ottimizzazione dei parametri. Protocollo di affinamento. Conformazioni delle catene laterali. Modellazione del solvente e di ligandi. Rfree e Rwork.
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Importanza della validazione. Statistica Bayesiana applicata alla validazione del modello cristallografico. Parametri globali e parametri locali. Analisi della geometria: angoli e distanze di legame, diagramma di Ramachandran, interazioni repulsive. Analisi della densità elettronica e parametri di correlazione per singoli residui. Validazione di presenza e geometria dei ligandi.
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Read the paper and spot significant crystallographic mistakes!
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Differenze tra elettroni e raggi X. Le principali tecniche di microscopia elettronica utilizzate nello studio strutturale di proteine. Il microscopio elettronico: sorgente, lenti elettomagnetiche, goniometro, detector. Camere a detezione diretta e loro caratteristiche. Principi fisici di formazione dell'immagine nel microscopio: approssimazione "weak phase object", effetto della lente dell'obiettivo (astigmatismo e aberrazione sferica), funzione d'onda nel piano focale posteriore (back focal plane), formazione dell'immagine. Contrast Transfer Function (CTF) e sua correzione con phase flipping e filtro di Wiener. Phase plate.
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Tecniche di microscopia elettronica per la biologia strutturale ad alta risoluzione. Raccolta dei dati: immagini e pattern di diffrazione. Crstallografia a elettroni. Preparazione dei cristalli bidimensionali. Preparazione del campione: negative staining e cryo-EM (sugar embedding). Raccolta dei dati di diffrazione: lo spazio reciproco dei cristalli bidimensionali. Analisi dei dati di diffrazione. Analisi delle immagini di microscopia elettronica di cristalli bidimensionali: filtering, unbending, correzione della CTF e merging per ottenere la mappa di proiezione. Due esempi di strutture ottenute con cristallografia a elettroni: bacteriorodopsina e acquaporina-0. Microscopia elettronica su particelle singole: Single-particle EM. Preparazione del campione per single-particle cryo-EM.
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Segnale e rumore nelle immagini di microscopia elettronica. Teorema del campionamento. Grandezze fondamentali. Low-pass filtering. Selezione delle particelle e masking. Riduzione del rumore mediante averaging. Selezione automatica delle particelle. Allineamento: procedura di analisi della rotazione e della traslazione. Eterogeneità del campione. Classificazione: Principal Component Analysis e metodi di classificazione di immagini bidimensionali. Metodo della classificazione gerarchica ascendente. Metodo K-means. Esempi di utilizzo della classificazione in negative staining e in cryo.
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Ricostruzione del modello tridimensionale da immagini bidimensionali. Angoli di Eulero e proiezioni. Teorema della proiezione. (1) Determinazione dell'orientazione delle particelle: tomografia, metodo del Random Conical Tilt, metodo delle linee comuni. (2) Ricostruzione. Correzione della CTF. Eterogeneità. Metodo basato sull'analisi statistica Bayesiana (software Relion).
Validazione del modello strutturale. Due esempi di errata ricostruzione. Risoluzione. Qualche esempio di proteine la cui struttura è stata determinata ad alta risoluzione con tecnica di cryo-EM.
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Download delle immagini di diffrazione della raccolta dati.
Installazione della suite di programmi CCP4, gratuita.
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